超分辨高精度顯微鏡3D成像模塊

光學顯微鏡憑借其非接觸、無損傷等優(yōu)點，成為生物學家研究細胞功能結(jié)構(gòu)、蛋白網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)、DNA等遺傳物質(zhì)、細胞器以及膜結(jié)構(gòu)等應用不可少的工具，然而衍射極限的存在，使得人們無法清晰地觀察到橫向尺寸小于200nm、軸向尺寸小于500nm的細胞結(jié)構(gòu)。二十一世紀初期，具有納米尺度分辨率的超分辨光學顯微成像技術(shù)的出現(xiàn)，使得研究人員可以在更高的分辨率水平進行生物研究。在超分辨顯微技術(shù)飛速發(fā)展的同時，現(xiàn)有成像技術(shù)的缺陷也日益顯現(xiàn)，例如成像分辨率和成像時間不可兼得；對透鏡制造技術(shù)提出了一定要求的同時，也限制了觀測的視野；日益復雜的設備使得操作和維護也越來越困難等。

為解決上述問題,美國Double Helix Optics公司提出了納米級分辨率成像的新概念-“SPINDLE"，不僅突破了衍射極限，還可以實現(xiàn)三維成像，可捕捉到小至橫向尺寸10 nm、軸向尺寸15 nm的細節(jié)。在該技術(shù)中，SPINDLE模塊被安裝在顯微鏡和ccd或相機之間，無需改變現(xiàn)有成像系統(tǒng)設置?；谔厥庠O計的相位掩模版，從工程化點擴散函數(shù) (E-PSF)出發(fā)，使用螺旋相位掩模板來控制景深、發(fā)射波長和精度，結(jié)合3DTRAX軟件對3D圖像進行重建和分析，可在不需要掃描的條件下即時捕獲 3D 信息，得到深度和精度3D圖像，橫向精度可達20nm, 軸向精度可達25nm，成像深度可達20um。當與其他工具和技術(shù)，包括STORM、PALM、SOFI、光片顯微、寬場、寬場顯微、TIRF、FRET等一起使用時，可釋放巨大的潛力，適用于活細胞、固定細胞和全細胞成像、單分子、粒子跟蹤和粒子計數(shù)等應用。

圖1：SPINDLE2雙通道顯微鏡模塊，用于同時多色、多深度3D成像

SPINDLE2可以被很容易地安裝到現(xiàn)有顯微鏡和CCD或相機之間，內(nèi)置旁路模式可輕松返回到非3D光路，是實現(xiàn)單發(fā)超分辨和3D寬場成像的理想解決方案。

圖2：非洲綠猴腎細胞的3D 圖像，微管和肌動蛋白分別標記，兩種顏色同時成像

在SPINDLE模塊中，最核心的是經(jīng)過特殊設計的相位掩模板，其尺寸和設計需和光學系統(tǒng)和成像條件相匹配。這些相位掩模板將單一物體發(fā)出的光分裂成兩個獨立的旋轉(zhuǎn)的光瓣，類似于雙螺旋。兩瓣的中點對應物體發(fā)光源的橫向位置，兩瓣的夾角對應發(fā)光源的軸向位置。由于旋轉(zhuǎn)180°時光斑可以保持聚焦，因此可以高精度地獲取發(fā)光“點"的深度信息。收集的數(shù)據(jù)由許多這些在不同方向上與物體橫向和軸向位置相對應的分離良好的點組成。經(jīng)過對這些詳細的目標點數(shù)據(jù)集處理和圖像重建創(chuàng)建，即可得到超高分辨率原始物體清晰的三維結(jié)構(gòu)。

圖3：工程化相位掩模板通過每幀成像更大的體積來節(jié)省時間和存儲空間，并降低感光度

豐富多樣的相位掩模板庫，包括雙螺旋，單螺旋，EDOF，四足，和多色設計以提供最大的控制和靈活性。用戶可依據(jù)深度范圍、波長和其他光學參數(shù)選擇合適的相位掩模版以滿足最佳的深度-精度平衡。

3DTRAX® 軟件用于計算每個粒子的z位置，運行專有算法以自動進行3D定位，以?20 nm的深度和分辨率渲染高精度3D圖像，用于單分子定位和跟蹤。對漂移進行自動校正并生成直觀的繪圖，同時保持高數(shù)據(jù)質(zhì)量。

圖4：3DTRAX®是非常易于使用的斐濟插件

使用適用于 Windows、MacOS 和 Linux 的庫集成到您的工作流程或 OEM 儀器中，以 ThunderSTORM 或雙螺旋文件格式保存圖像并導出文件以供進一步分析，專有的反卷積算法可以在不損失精度的情況下重建全細胞圖像。

圖5：從左到右：非洲綠猴腎細胞的細胞骨架，小鼠胚胎成纖維細胞中的微管，小鼠胚胎成纖維細胞細胞核中的復制DNA的3D超分辨圖像

超分辨顯微鏡3D成像模塊應用

超分辨顯微成像和3D粒子跟蹤技術(shù)為生物學和生物醫(yī)學研究、藥物發(fā)現(xiàn)、材料科學研究和工業(yè)檢測打開了一個充滿可能性的新世界。雙螺旋工程技術(shù)具有高達傳統(tǒng)顯微鏡30倍的成像深度，其為超分辨成像帶來精度-深度平衡。在3D粒子追蹤應用中，雙螺旋工程帶來的擴展的深度可以實現(xiàn)更長粒子軌跡的捕獲。

在生命科學領(lǐng)域，雙螺旋光工程正在從癌癥和免疫學到傳染病和神經(jīng)科學的生命科學的突破。研究人員通過使用SPINDLE模塊發(fā)現(xiàn)了新的細胞結(jié)構(gòu)和亞細胞的相互作用。研究神經(jīng)退行性疾病的科學家們能夠看到以前從未見過的壓力顆粒核3D圖像。同樣，研究免疫學的研究人員已經(jīng)能夠重建整個T細胞。

在藥物開發(fā)領(lǐng)域，研究人員已經(jīng)可以看到和跟蹤藥物化合物的真正工作原理，而不是簡單地模擬新的化合物。雙螺旋光工程實現(xiàn)了在成像和單粒子跟蹤(SPT)領(lǐng)域的新突破，隨著追蹤分子的能力跨越更大的景深（高達20um），雙螺旋可以記錄比以往任何時候更長的軌跡，使得識別先導化合物和加快藥物發(fā)現(xiàn)變得更加容易。

在材料科學領(lǐng)域，借助3D納米成像和粒子跟蹤技術(shù)，無論是金屬、半導體、陶瓷、聚合物還是納米材料研究，雙螺旋技術(shù)都可以讓您看到材料的結(jié)構(gòu)、流動性等性能。精密成像與深度擴展相結(jié)合，讓你對粒子動力學有了新的認識。有了更多的數(shù)據(jù)，就可以更好地預測材料在任何給定應用領(lǐng)域中的性能。

在工業(yè)檢測領(lǐng)域，雙螺旋工程可實現(xiàn)納米尺度的三維檢查。現(xiàn)在你可以在從微芯片到像素級的產(chǎn)品中發(fā)現(xiàn)微小的缺陷和其他功能缺陷。納米級精度的檢測，可以提高質(zhì)量控制，節(jié)省時間，降低成本，提高產(chǎn)量和跟蹤質(zhì)量。

引文：[1]金錄嘉, 何洋, 瞿璐茜,等. 新型超分辨顯微技術(shù)的最新研究進展[J]. 光電產(chǎn)品與資訊, 2018, 9(3).

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相關(guān)文獻：

(1)Anastasiia Misiura, et. al., “Single-Molecule Dynamics Reflect IgG Conformational Changes Associated with Ion-Exchange Chromatography," Analytical Chem., 2021

(2)Laura Hoppe Alvarez, et. al., “Controlling microgel deformation via deposition method and surface functionalization of solid supports,"

Phys. Chem. Chem. Phys., 2021,23, 4927-4934

(3)Xilin Yang, et. al., “Deep-Learning-Based Virtual Refocusing of Images Using an Engineered Point-Spread Function," ACS Photonics, 8, 7, 2174–2182, June 2021

(4)Anish R. Roy, et. al., “Exploring cell surface-nanopillar interactions with 3D super-resolution microscopy," BioRxiv, June 2021S. Li, J. Wu, H. Li, D. Lin, B. Yu, and J. Qu, “Rapid 3D image scanning microscopy with multi-spot excitation and double-helix point spread function detection," Optics Express, vol. 26, no. 18, p. 23585, 2018.

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